/TOMÁŠ FÜRST, ZUZANA KRÁTKÁ, ŠTĚPÁNKA LUXOVÁ, HALINA ŠIMKOVÁ, JAN STROJIL/
Centrum pro bayesovsou inferenci 4B|N www.4bin.org.
Když Němci něčemu nerozumí, řeknou, že je to pro ně „jako české vesnice“ (böhmische Dörfer). Pro nás je to vesnice španělská. A jako na procházce španělskou vesnicí si můžete připadat, když začnete porovnávat výsledky různých testů protilátek proti novému koronaviru. Nedávno jsme při jedné takové procházce narazili na něco, co vypadá jako zvonky na čínském paneláku.
Při bližším pohledu se ze zvonků vyklubou výsledky takové malé ověřovací studie. V ní jsme vzali séra, ve kterých byly Elisou Euroimmun – zlatým standardem imunologických testů – detekovány pozitivní protilátky proti SARS-CoV-2 a měření jsme zopakovali pomocí rychlotestů.
Šlo tedy o séra pacientů, kteří prodělali infekci koronavirem a vytvořili si protilátky. Tato séra jsme znovu otestovali pomocí rychlotestu INNOVITA nebo Wantai. Zvonky v sudých patrech odpovídají vyšetření protilátek IgM (ty se vždy tvoří jako první po setkání s virem, dřív než IgA) a zvonky v lichých patrech patří vyšetření protilátek IgG (ty se tvoří o několik dní později). U dvou vzorků jsme využili i rychlotest Wantai, ve kterém se stanovuje celkový imunoglobulin (všechny protilátky proti koronaviru, tedy směs IgG+IgM+IgA). To jsou ty dva zvonky na samotku vpravo nahoře. Vyšetřované vzorky byly od lidí, kteří se zúčastnili screeningové studie, aby se dozvěděli, jestli měli infekci koronavirem. V době testování museli být alespoň 14 dní zdraví. Předpokládali jsme, že pokud infekci měli, tak nyní už mají protilátky vytvořené. Než vám řekneme, jak to dopadlo, pozveme vás na krátký online kurs principů imunologických testů:
Rychlotesty fungují tak, že se 10 mikrolitrů séra (z 20 mikrolitrů krve) kápne do jamky (na zvonku vpravo), přidají se dvě kapky speciálního roztoku a 15 minut se (za zpěvu čínské hymny) čeká. Pak se odečte reakce – přítomnost jediného proužku v zóně C znamená, že test byl úspěšný, ale protilátky pacient nemá. Přítomnost dvou proužků (v zónách C i T) znamená, že pacient protilátky má. Jak tato kouzelná analýza probíhá? V roztoku, který přikapáváme do jamky, jsou kuličky s navázaným antigenem. Pokud má testované sérum příslušné protilátky, ty se na antigen specificky naváží a celá tato kuličková směs vzlíná po nitrocelulózovém proužku až do zóny T. Zde jsou připravené anti-IgM (nebo anti-IgG nebo anti-Ig protilátky), které komplex kuliček s prokazovanými protilátkami zachytí a výsledkem je barevná reakce. Za čtvrt hodiny máme jasno.
Elisa test je metoda s výrazně složitějším postupem. Nehledáme čárku, ale přímo stanovujeme množství protilátek. V 96jamkové destičce je na dně navázaný specifický antigen (např. S1 podjednotka SARS-CoV-2). Do destičky napipetujeme zředěné sérum, po inkubaci se protilátky naváží na antigen a vše ostatní z destičky odmyjeme. V dalších krocích se provede enzymatická reakce, jejímž výsledkem je vznik barevného roztoku. Spektrofotometrem změříme intenzitu zbarvení roztoku a porovnáme zbarvení vzorku se standardem. Samozřejmostí pro tento test je změření pozitivní a negativní kontroly na destičce, u kterých víme, jaká hodnota má vyjít, pokud je test validní.
Elisa IgG od Euroimmunu patří k nejkvalitnějším diagnostickým soupravám, které máme dispozici. Má senzitivitu 94 % a specificitu 99 %, tedy pozná správně 94 % pozitivních případů a jen u jednoho ze sta negativních vyjde falešně pozitivně. Je natolik citlivá, že dokáže zachytit protilátky i u lidí, kteří COVID-19 prodělali před několika měsíci nebo bezpříznakově. Této soupravě byl udělen po sériích nezávislých testování i certifikát FDA. ELISA IgA je jeden z mála testů, které jsou pro IgA protilátky u SARS-CoV-2 k dispozici. Je velmi citlivý (senzitivita 99 %), ale míň specifický (specificita 90 %). Víme tedy, že ne každý IgA pozitivní výsledek opravdu znamená prodělané onemocnění COVID-19. Výsledky IgA musíme porovnávat s výsledky IgG a s klinickým průběhem. Tím odlišíme falešně a správně pozitivní osoby. Tato souprava se používá například při testech na Strakonicku a Písecku, kolem kterých nedávno vypukl mediální rozruch. Na výsledky se těšíme, protože doufáme, že na rozdíl od státem sponzorované studie SARS-CoV2-CZ-Preval, vnese jihočeské testování do španělské vesnice trochu porozumění.
Vraťme se ale k čínskému paneláku. Jak jsme uvedli výše, použili jsme deset vzorků, které byly na Elisa Euroimmun testu pozitivní na protilátky. Abychom byli přesní – pět z nich mělo pozitivní IgG a devět mělo pozitivní IgA.
Provedli jsme vyšetření rychlotestem INNOVITA (2019-nCOV Ab Test) na stanovení IgM a IgG. Získali jsme jen jeden pozitivní výsledek IgG! Na IgM nebyl pozitivní dokonce žádný! Ano, v ELISA testu jsme sice měřili IgA, ale IgM vzniká jako první, tedy určitě ho pacienti (někdy) měli.
Výrobce v příbalovém letáku uvádí senzitivitu 87,3 % a specificitu 100 %. V našem pokusu byla ovšem senzitivita rozhodně blíže nule než deklarovaným 87 procentům. Test je možná dobrý na testování pacientů v nemocnicích, kteří právě infekci prodělávají a jejich imunitní systém pracuje na plný výkon. Z našeho malého verifikačního testu však vyplývá, že při testování bezpříznakových osob není dostatečně citlivý a protilátky nezachytí. Mimochodem odborníci na tento problém upozorňovali už před několika měsíci a na ministerstvu to tehdy vysvětlovali takto.
Rychlotest Wantai (WANTAI SARS-Cov-2) dopadl o něco lépe, protože jsme mu v naší ověřovací studii usnadnili práci. Předhodili jsme mu dva vzorky, které byly z našich 610 osob vyšetřených Elisa Euroimmun testem nejvíce pozitivní, tedy obsahovaly největší množství protilátek. Rychlotest u jednoho pozitivní výsledek potvrdil. Ovšem u druhého pacienta, který COVID-19 prodělal a měl dle Elisa vysoké koncentrace IgA i IgG, byl výsledek rychlotestu pozitivní jen slabounce (zvonek vpravo nahoře). Víc testů jsme prozatím bohužel neměli k dispozici. Souprava Wantai má výrobcem delarovanou senzitivitu 95,6 % a specificitu 95,2 %. Tento test použili v celorepublikové studii SARS-CoV2-CZ-Preval, přičemž její autoři (pro nás poněkud nepochopitelně) tvrdí, že rychlotesty „byly verifikovány se stoprocentně správným výsledkem“ (zdroj zde, snímek 6). Verifikovány byly, ale patrně na pacientech silně příznakových. Takových ovšem potom do odběrových stanů asi moc nedorazilo.
Co z toho tedy plyne? Když už se pustíte na procházku španělskou vesnicí a narazíte u toho na čínský panelák, nezvoňte. Prostě nezvoňte!